|
|
Медицинская энциклопедия |
Медицинский справочник |
|
|
|
|
Главная >> Медицинские статьи >> Лабораторная диагностика
Микрометод определения актвности трипсина в биологических жидкостяхАлехин С.А. Липатов В.А. Курский государственный медицинский университет, каф. хирургических болезней № 2, каф. оперативной хирургии и топографической анатомии www.drli.h1.ru
Определение активности трипсина является важным критерием в диагностике острого панкреатита. До настоящего времени основным методом определения активности трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина от его концентрации используемого для построения калибровочного графика, сложность расчетов.
Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей методики.
Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях.
Метод основан на расщеплении трипсином синтетического бесцветного субстрата — бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина, количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c микрокюветами при длине волны 410 нм.
Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в модификации Шатерника.
Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в Microsoft Excel.
Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график. Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.
Ход определения: В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410). Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре 370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).
Расчет активности трипсина производят в три этапа 1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна: DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))
2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:
y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6 , где b и с константы
Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y = 874,45*x 1 + 84,94*x2 В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у – количество образовавшегося р-нитроанилина.
В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального уравнения для данных этой калибровки.
3. Непосредственно расчет активности трипсина.
Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.
Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения, показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.
Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у * 4) / 30. Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл. Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов. Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и построения калибровочного графика и их автоматизация. Использование уравнения полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью автоматизировать расчет, но и вести базу данных.
Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 - 59. 25.07.2003
|
|
Смотрите также: Основные моменты тактики лечения больных с язвенными гастродуоденальными кровотечениями (ЯГДК), Принципы диагностики и лечения острых кишечных инфекций, Первично прогредиентная форма клещевого энцефалита, Как восстановить и укрепить иммунитет?, Модель лучшей практики для телеконсультирования в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии Интересные факты:
Проблемы нарушений слуха у пожилых людей Одна из самых важных перемен в современном обществе – это его "старение". Количество пожилых людей в мире непрерывно возрастает. Причем этот сдвиг не только количественный, но и качественный. Если до недавних пор считалось, что старость начинается в 65 лет, то сегодня эта точка зрения уже устарела. В наши дни многие 65-летние люди работают и ведут активный образ жизни.
| Опыт применения альгината калия для лечения заболеваний губ у детей Л.Н.Горбатова Медицинская академия, г.Архангельск Заболевания слизистой оболочки и красной каймы губ относятся к числу распространенной патологии у детей, проживающих в регионе Европейского Севера. Так, по нашим данным у 44.13% детей встречается хейлит, причем 7% приходится на заболевания губ аллергической природы. Особое место занимает хейлит при кожных аллергозах, в частности, ней
| Дисфункции билиарного тракта у детей. Опыт применения Гепабене в комплексном лечении билиарных дисфункций у детей Г.В. Волынец, А.И. Хавкин Под дисфункциями билиарного тракта понимают нарушения регуляции секреции желчи, моторно–эвакуаторной функции желчного пузыря, желчных протоков и нарушение тонуса сфинктера Одди, приводящие к застою желчи [5,7,8,10,11,12,13]. Основной функцией желчного пузыря является накопление желчи и ее концентрация; сократительная функция, секреторная, ферментативная и регул
| Стероидозависимая бронхиальная астма Рустем Салахович Фассахов Оксана Евгеньевна Богоутдинова Дарья Ивановна Владимирова Кафедра аллергологии и клинической иммунологии Казанской государственной медицинской академии
| Безопасность корпоративного младенца Алексей Лукацкий Бизнес-консультант по безопасности, компания Cisco Systems Очень часто мне приходится слышать, что информационная безопасность - это трудно, ново, непонятно и т.д. На самом деле все не так. Защита информации - дисциплина хоть и новая, но имеющая корни, уходящие в древность, еще до нашей эры. Но разговор пойдет не об этом. Я покажу, что безопасность информационной сис
|
|
|
|